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Métodos para identificar resistencia a antibióticos de microorganismos.

El uso indiscriminado de antimicrobianos en la Industria promueve la adaptación paulatina de los microorganismos a los mismos. Esto significa, por ejemplo, que una mayor concentración de un mismo antibiótico debe ser utilizado para mitigar una misma cepa. Sin embargo, es difícil determinar si una infección no logra ser mitigada por una adaptación del microorganismo al antibiótico, o es que tal vez el antibiótico no es el correcto para tratar ese tipo de infección.  Además, muchas veces para una misma enfermedad se utilizan distintos antibióticos, para los cuales el microorganismo puede generar una resistencia selectiva o mayor a uno que a otro. Es por ello que es de suma importancia estudiar la resistencia y sensibilidad hacia los antibióticos que las cepas circundantes y estándar en la producción agropecuaria presentan. En este artículo se describen las diversas metodologías para determinar la capacidad de resistencia que pueden presentar los microorganismos específicos.

Antibiograma (Método de disco)

El antibiograma es un método de difusión, y es uno de los estudios más utilizados. Consiste en utilizar una cepa estándar de microorganismo en una placa de agar, sobre la cual se presentan varios discos de papel (u otros materiales) embebidos en diversos antibióticos a concentraciones conocidas. Otra variante de esta metodología es presentar en cada disco una concentración distinta de un mismo antibiótico, para determinar la dosis mínima o más efectiva para combatirlo.

La capacidad de crecimiento del microorganismo estándar alrededor de estos discos permite determinar la resistencia baja, media o alta frente al antibiótico o dosis ensayada. Estas resistencias se observan a simple vista, y dependen del tamaño del halo sin crecimiento que se desarrolla en torno al disco con la condición ensayada, como se muestra en la Figura 1. Los halos son medidos para poder clasificar al microorganismo.

 Figura 1. Antibiograma tipo, donde se pueden observar las distintas capacidades de crecimiento por presencia de halos transparentes en torno a los discos dispuestos en las placas. Imagen extraída de M. McCarthy (2018)(1).

Métodos automatizados – microdilución en caldo

El método automatizado más utilizado es el de microdilución en caldos. Este método se encuentra basado en el método de dilución, el cual consiste en colocar concentraciones crecientes de antibióticos en caldos de cultivo con microorganismos en suspensión. La observación periódica del crecimiento de los microorganismos en el caldo con el antibiótico en cuestión permite determinar su sensibilidad frente al componente. 

En la microdilución, se utilizan dispositivos automáticos para dispensar y diluir pequeñas cantidades de caldos y antibióticos en una placa de pocillos con forma de U. El crecimiento de los microorganismos se observa a través de mediciones de turbidez o fluorescencia, utilizando un equipo específico para ello.

Figura 2. Método de microdilución en caldo. A partir de las columnas 8 y 9 se puede observar el crecimiento de microorganismos en las diversas condiciones ensayadas. Imagen extraída de Cantón, E. Et al (2007)(2).

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas es una técnica ampliamente utilizada en los laboratorios de microbiología para la realización de diversos ensayos. Esta técnica tan sensible y rápida ha sido reportada como de gran potencial para ser aplicada en la determinación de la sensibilidad y resistencia a antibióticos en microorganismos(3).

La técnica de espectrometría de masas se utiliza para determinar qué tipo de moléculas componen una muestra. Para ello, se utilizan iones cargados que generan un espectro de masas característico para cada componente en esa muestra. 

Es de esta manera que un determinado microorganismo presenta un espectro tipo. Cualquier variación observada en este espectro respecto al estándar, significa que existe una diferencia a nivel biológico. Es por ello que, si un microorganismo se vuelve resistente a un antibiótico, habrá ganado o perdido funcionalidades por presencia o ausencia de ciertas moléculas. 

Dado esto, para poder utilizar esta técnica libremente, se debe generar un banco de espectros tipo para los microorganismos, siendo estos resistentes o no a antibióticos para así poder comparar la muestra ensayada.

Figura 3. Esquema de qué información puede obtenerse mediante el uso de la técnica de espectrometría de masas. En el mismo puede observarse el espectro (gráfica con picos) que podría obtenerse por el análisis de una muestra con un microorganismo determinado. Imagen extraída de How, T-Y. et al (2019)(3).

De esta manera, se podría determinar más rápidamente y con menos costos asociados la capacidad de resistencia frente a los diferentes tipos de antibióticos en el mercado. A pesar de la gran potencialidad que presenta esta técnica, aún se encuentra en desarrollo.

Bibliografía

1. McCarthy M. Single bacterial super-clone behind world epidemic of drug-resistant E. coli. UW News. 2013; 

2. Canton E, Martín E, Espinel A. Pruebas estandarizadas para el estudio de la sensibilidad a los antifúngicos. Guía Práctica Identificación y Diagnóstico en Micol Clínica. 2007;1–24. 

3. Hou T-Y, Chiang-Ni C, Teng S-H. Current status of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical microbiology. J food drug Anal. 2019;27(2):404–14.