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Diagnóstico de enfermedades en aves por método de PCR

Según el último informe de la FAO, la producción mundial de la carne de pollo ha tenido un incremento sostenido en el tiempo, y se prevé que en el 2020 continúe con esta tendencia(1). Cabe destacar que estas perspectivas se conciben aún a pesar del período COVID-19, durante el cual la venta y producción internacional de carne ha decaído. Respecto a Uruguay, la avicultura genera más de 10.000 puestos de trabajo en el departamento de Canelones. Dado el contexto mencionado, así como también las exigencias de los mercados internos y externos respecto a la trazabilidad de los alimentos, resulta de suma importancia contar con técnicas de diagnóstico rápidas y eficientes para asegurar la calidad y eficiencia de la producción avícola nacional. Este es el caso del método PCR en tiempo real, sobre el cual se elabora en este artículo.

Una de las técnicas más utilizadas a nivel internacional de alta calidad y eficiencia, es la Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (PCR en tiempo real). Esta técnica presenta múltiples beneficios frente a otras existentes en el mercado, como lo es el método de ELISA y cultivo por microbiología clásica, ya que permite realizar un diagnóstico de alta sensibilidad en pocas horas, y a un mayor número de patógenos. Es decir, al ser una técnica tan sensible, puede detectar la presencia de hasta un microorganismo por muestra analizada. Sumado a esto, los patógenos no necesitan ser cultivados previamente, aumentando así la variedad de los que pueden ser analizados. 

PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real es un método de biología molecular que consiste en la amplificación de una secuencia de ADN seleccionada, que identifica la presencia de aquel patógeno que se desea diagnosticar en la muestra. Esta metodología permite ver, gracias a la presencia de un compuesto coloreado llamado fluoróforo, la cantidad de ADN generado durante la reacción de amplificación del ADN. Por ende, si la muestra cuenta con al menos un microorganismo objetivo, la reacción brindará un resultado positivo, que tiene la forma de una curva característica, como muestra la Figura a continuación.

Figura 1. Resultado positivo típico de una PCR en tiempo real exitosa. Como se puede observar, a medida que pasa el tiempo (medido en ciclos) la curva evoluciona en forma de “S”. Esto refiere a que el ADN se multiplica exponencialmente, hasta que ya no puede hacerlo más por falta de reacitvos (meseta a partir del ciclo 38 en adelante). Figura adaptada de Castro-Cárdenas et al. (2011)(2).

Para poder realizar esta reacción de diagnóstico, se suele contar con kits específicos que contienen: la enzima de amplificación de ADN, las secuencias llamadas primers que permiten encontrar el gen buscado, los nucleótidos para generar las nuevas hebras de ADN, el fluoróforo para seguimiento de la reacción y el medio líquido con las sales necesarias para la reacción. Este mix, junto con ADN aislado de la muestra que se desea analizar, es colocado dentro de un equipo específico de PCR en tiempo real. Este equipo permite la medición de las señales emitidas por el fluoróforo emitido durante las reacciones de multiplicación del ADN a intervalos de tiempo muy pequeños. Se requiere de personal especializado en esta metodología para poderla llevar adelante e interpretar los resultados obtenidos.

Patógenos avícolas identificados por PCR en tiempo real

En la actualidad, una gran cantidad de patógenos pueden ser identificados a través de la técnica en PCR en tiempo real. Para su detección, existen kits de PCR comerciales que permiten la automatización del diagnóstico. Ejemplos de ellos son: Salmonella Spp., Bronquitis Infecciosa, Mycoplasma, Campylobacter, Clostridium, Influenza y enfermedad de Newcastle, entre otros. En particular, este método también permite profundizar en la cepa del patógeno, lo cual no sucede en las técnicas como microbiología clásica y ELISA. Por ejemplo, se puede diferenciar entre Salmonella Enteritidis y Typhimurium, lo cual permite tomar medidas correctivas y preventivas a medida.

Bibliografía

1. (FAO) F and AO of the UN. Food Outlook [Internet]. 2020. 1-142 p. Available from: www.fao.org/publications2. Castro-Cárdenas LA, Llaca-Díaz JM, Pérez-Chávez F, Gómez-Espinel IA, Flores-Aréchiga A. Estudio comparativo entre una prueba rápida y RT-PCR tiempo real en el diagnóstico de influenza AH1N1 2009. Salud Publica Mex. 2011;53(4):329–33.